技术支持

M20-seq是全球首个基于随机引物策略的全样本高通量单细胞全长测序技术。其核心是通过具有自主知识产权的随机引物体系，打破了传统polyA捕获方法对样本的限制，实现了对各类RNA（包括lncRNA、降解RNA等）的全长测序，并显著提升了单细胞水平的基因检出数量与准确性。

传统单细胞测序依赖polyA尾捕获，仅适用于完整的真核细胞mRNA。而M20-seq采用随机引物策略，不依赖polyA尾结构，可捕获包括降解RNA、无polyA结构的原核RNA在内的各种RNA分子，因此可兼容石蜡包埋（FFPE）、RNA降解及细菌样本等特殊类型。

VITA平台由三大部分组成：VITAcruizer® 单细胞制备仪（负责单细胞捕获与文库制备）、VITApilote® 试剂盒（提供配套耗材与反应体系）、VITAseer® 软件及数据平台（完成数据分析、可视化及下游科研解读）。

主要流程包括：① 样本制备（单细胞/单菌悬液制备）→ ② 单细胞捕获（VITAcruizer® 仪器完成，约17分钟）→ ③ 逆转录与扩增 → ④ 文库建库 → ⑤ 测序（兼容Illumina及BGI平台）→ ⑥ 数据分析（VITAseer® 平台）。

单细胞捕获环节仅需约17分钟，完成后可在逆转录前暂停，样本可短暂存储于-80°C。整体流程从单细胞悬液制备到完成建库约需1~2天，具体视样本类型而定。

VITAcruizer® 捕获效率高，5000个细胞时双胞率 < 2%；标准通量1000～20000个细胞，超高通量模式最高可达百万个细胞；基因检出数相较polyA方法大幅提升，lncRNA占比可达10%，mRNA至3'端基因覆盖度从5'至3'均匀分布。

完全兼容。VITAseer® 平台输出的数据格式与业界主流格式对齐，可直接导入Seurat、Scanpy等常用单细胞分析软件进行后续深度分析，降低用户的迁移成本。

FFPE（石蜡包埋）样本是临床最常用的保存方式，存量丰富且附有完整临床信息。VITA平台支持FFPE样本直接进行单细胞转录组分析，无需新鲜样本，突破了传统单细胞技术对样本类型的限制，使大量历史临床样本的再利用成为可能。

FFPE样本经脱蜡、复水、解离等处理后，RNA会有一定程度的降解，但VITA平台基于随机引物的M20-seq技术可以有效捕获降解RNA片段，从而保证足够的检测深度和基因覆盖度，不影响主要的转录组分析结论。

建议FFPE样本固定时间不超过24小时，切片厚度5～10μm，样本保存时间一般不超过5年。提交前建议进行RNA质量预检（DV200 ≥ 30%），以确保实验成功率。

新鲜细胞通常不需要固定，可直接制备成单细胞悬液进行检测。若因转运或时间限制，可采用甲醇固定等方式短暂保存，VITA平台同样兼容固定后的细胞样本。

总体细胞亚群分类和主要基因表达趋势一致，但FFPE样本由于RNA部分降解，单细胞检出基因数会略低于新鲜样本。在细胞类型注释和差异基因分析上，两者结果具有良好的一致性。

一般建议捕获细胞数3000～10000个，测序深度每细胞2～5万reads，具体可根据研究目的和细胞类型复杂程度调整。如需检测稀有细胞亚群，建议适当增加捕获细胞数和测序量。

基于M20-seq全长测序策略，lncRNA占所有检测到转录本的约10%，mRNA（蛋白编码基因）约占60%～70%，其余包括rRNA（已通过技术手段降低占比）、snRNA、snoRNA等非编码RNA类型。

VITA平台对细菌的形状（球菌、杆菌、螺旋菌等）无特殊限制，细菌直径一般在0.3～5μm均可适用。超大或超小的特殊细菌需提前咨询技术团队进行方案评估。

单菌是指在单个微滴中捕获单个细菌细胞。同一物种不同菌株混合后，每个液滴中理论上仍只包含一个细菌个体，仍属于单菌检测。不同菌株的转录组差异可通过后续基因组比对分析区分。

不一定需要富集培养。可通过差速离心、过滤等物理方法直接从粪便样本中制备细菌悬液。若目标细菌丰度极低，可根据具体研究需求决定是否进行选择性富集，但富集可能引入扰动，需谨慎评估。

建议捕获细菌数500～5000个，最低500个可进行基础分析。测序量建议每个细菌50000～100000 reads，以保证足够的基因覆盖深度。具体数量可根据研究物种和转录组复杂程度调整。

针对原核生物rRNA占比高（可达80%以上）的问题，VITA平台可在建库过程中整合rRNA去除步骤，采用CRISPR-based depletion或探针杂交捕获法有效降低rRNA比例，从而富集目标mRNA信号。

Bulk RNAseq只能反映群体平均基因表达，无法揭示细菌群体中的个体差异与异质性。单细菌转录组可以在单细胞分辨率下识别不同表达状态的细菌亚群，发现耐药细菌、持留菌等稀有亚群，深入理解菌群在不同环境压力下的响应机制。

可以。VITA单细菌转录组可对野生株和突变株在转录水平的全面差异进行检测，包括差异表达基因、转录因子调控网络变化等，为深入理解点突变对基因表达调控的影响提供定量数据支持。

单细菌转录组通过细胞计数可大致反映相对丰度，但受捕获效率影响，不能完全等同于宏基因组测得的绝对丰度。与宏转录组在主要物种的相对丰度上具有较好的一致性，但在极低丰度物种的检出上各有优劣。

功能注释分析通常需要参考基因组进行序列比对与基因定量。若无参考基因组，可使用de novo组装后进行功能注释，或采用宏基因组参考数据库辅助分析，但精度会相对降低。

可以。将两种细菌共培养后制备混合悬液，VITA平台可同时捕获并测序，通过序列比对将reads分配至不同物种，再分别分析各物种在共培养条件下的转录变化，从而推断两者之间的互作机制。

单细菌转录组提供的是相关性分析层面的证据，用于发现候选亚群和潜在调控机制。若需建立因果关系，通常还需结合基因敲除/过表达、表型鉴定、蛋白互作等功能验证实验，以全面证实生物学意义。